噬菌体作抗菌剂的安全性评价研究
噬菌体发展的驱动因素：噬菌体因其病毒本质，作抗菌剂使用时其安全性常倍受质疑，为探究与论证噬菌体的安全性，综述了近年来噬菌体相关安全性评价的研究结果。以往研究中，无论是动物试验，还是人体临床试验，均证实噬菌体不会对机体产生明显的副作用，而最新的研究揭示了人体内源性噬菌体的存在及其可能的益生作用。噬菌体的应用被认为安全性较高，对于噬菌体的传统认知，可能将被颠覆与更新，不过仍有必要深入开展更为系统的研究，以及从分子水平上探讨噬菌体对人体细胞可能产生的影响。
噬菌体的潜在价值：致病菌抗生素耐药性问题日趋严重，已使现代医学界与兽医学界面临巨大的挑战。许多研究均表明，无论是临床相关致病菌，还是动物源性致病菌，大多已对常用抗生素普遍耐药，而许多食源性致病菌也表现出较为严重的耐药性。因此，研发出抗生素替代物及能有效针对食品高危致病菌性污染的抗菌剂尤为迫切。
噬菌体是细菌的天然克星，其本质为一类细菌病毒，可感染并裂解对应的宿主细菌，从而具有用作抗菌剂的可行性。近年来，在现代医学与兽医学领域，噬菌体用于治疗使用，尤其对治疗抗生素难治性感染，已彰显出巨大潜力。在食品工业中，噬菌体作抗菌剂使用，尤其对防控如大肠杆菌O157、沙门氏菌、李斯特菌等高危致病菌造成的食品污染，也展现出巨大潜力。因此，噬菌体极有潜力被开发成为一种高效的治疗剂或食品抗菌剂。
噬菌体作抗菌剂使用的安全性评价研究
噬菌体无处不在，被认为是地球上最为丰富的物种，总量可达惊人的10^31个左右。另据Weinbauer估算，在地球水体环境中噬菌体密度可达10^4～10^8 PFU/mL；在根际及土壤环境中密度约为1.5×10^8 PFU/g。Bergh等表明，在未受污染的水体中，噬菌体的密度约为10^8 PFU/mL。人体或动物体被这些巨量的细菌病毒包围，必然长期较大概率地与其反复接触。实际上，从健康人体、动物体和食品中，均易检测出噬菌体。显然，这些细菌病毒并未对人或动物造成危害。迄今为止，也未见任何有关噬菌体感染人体的报道。病毒通常具有严格的宿主特异性，因此，可以认为噬菌体不会感染人或动物细胞。
动物试验研究
尽管噬菌体被认为不会感染人或动物细胞，在临床使用前对噬菌体进行安全性评价仍尤为重要。近年来，已有大量相关动物试验被报道，受试对象包括小鼠、豚鼠、大鼠、家兔、鸡、猪、牛、羊等。结果均表明，噬菌体的使用，安全性较高。但值得注意的是，药物的毒性效应与剂量和给药方式密切相关。在常用治疗剂量下，药物可能很少表现出毒性作用，但在高剂量下，却往往会产生一定的副作用甚至毒理作用。此外，胃肠外给药比局部给药或口服给药等更易导致药物毒理作用的发挥。因此，开展急性毒理试验尤为必要。
Bogovazova等以小鼠和豚鼠为受试对象，评价了噬菌体的急性毒理性，研究结果表明，受试对象经肌肉注射、腹腔注射和静脉注射等不同胃肠外给药后，并未出现任何不良反应。此外，即使将噬菌体剂量提高至常用治疗剂量的3500倍，也未产生明显的毒理作用或引起任何组织学上的病变。Wang等研究表明，在对小鼠腹腔急性攻毒高剂量的噬菌体后，未引起任何副作用或各脏器组织学上的病变。而其他许多研究，尽管未设置严格的急性毒性试验，仍表明噬菌体以高剂量胃肠外给药，不会产生毒理作用。
除剂量与给药方式外，用药时长也是关键因素。亚慢性或慢性毒理试验，可用于检验噬菌体长期反复染毒机体后，可能产生的慢性毒理作用。据报道，Hwang等让大鼠每日口服10^8 PFU/mL噬菌体，在连续进行28d后发现，受试对象并未出现任何不良反应，大鼠采食量、饲料转化率、体质量和脏器指数均与对照组无显著差异。此外，研究者还表明，受试大鼠的肝、肾和脾未出现组织学上的病变；其血清中12种促炎细胞因子的水平均显示正常，机体未出现任何炎症征兆。而Biswas等在对小鼠腹腔长期反复接种高剂量(10^10 PFU)的噬菌体后，受试对象未出现不良反应。Mai等使小鼠连续90d饮水口服噬菌体，结果表明受试对象心、肺、肝、肾、脾和胃未出现组织学上的病变，并且其血常规指标均正常。
除毒理性外，一些药物的使用如抗生素，可能也会破坏机体微生态环境，由此常引发菌群失调或继发性感染。不过，一些学者表明，噬菌体的使用不会破坏受试动物肠道内的正常菌群。如Mai等让小鼠连续90d饮水口服噬菌体，随后定期采集小鼠肠道内容物，并进行细菌群落结构差异的变性梯度凝胶电泳（简称DGGE）分析，结果表明噬菌体的长期使用不会破坏小鼠肠道的微生态环境。噬菌体不像其他广谱抗菌剂，它具有严格的宿主特异性。并且，治疗所用噬菌体，通常仅针对致病菌，而这些病原微生物一般不会存在于健康者体内。
此外，某些药物因其免疫原性，常引发严重的变态反应，甚至引发变态反应性疾病。鉴于噬菌体是大分子物质，应高度重视。噬菌体（通常是它的衣壳蛋白）尽管具有免疫原性，但被证实免疫原性较弱，不会刺激机体产生严重的变态反应。如Biswas等报道，在对小鼠长期反复腹腔接种高剂量的噬菌体后，噬菌体诱导产生的免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）相对滴度较低，并且IgG高峰于多次免疫后的74d才出现，表明其免疫原性较弱；在试验过程中，未观察到小鼠出现任何变态反应。综上所述，噬菌体用于动物，甚至用于免疫功能不全的动物，具有较高的安全性。
人体临床试验研究
噬菌体自1917年被发现以来，在东欧地区尤其是在格鲁吉亚和波兰被尝试用于治疗人体各类细菌性感染。许多早期的临床研究均表明，噬菌体的使用未产生任何明显的副作用。近年来，来自波兰免疫学及试验性治疗研究所的研究团队发表了大量有关噬菌体临床治疗的研究结果，其中包括在免疫功能不全患者身上开展的研究。结果均表明，噬菌体具有较高的临床安全性。而另一支团队所开展的临床研究，同样备受关注。该团队来自著名的Eliava研究所，该研究所位于格鲁吉亚首都第比利斯，曾是世界上最大的噬菌体治疗研究机构，创建人包括著名的噬菌体发现者Felix d'Herelle。其研究结果同样表明，噬菌体用于人体，安全性较高。
近年来，一些设置随机对照试验的研究被报道：据Bruttin等报道，15名健康自愿者在口服噬菌体T4后，未出现任何严重的临床反应，血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平均正常，体内未检测出抗噬菌体IgG、IgM、免疫球蛋白A（IgA），肠道内大肠菌群未受到影响，体内的噬菌体未出现增殖迹象。另据Sarkers等报道，15名健康自愿者在口服T4噬菌体后，未出现任何不良反应，肝功能指标、肾功能指标和血常规指标均显示正常，体内正常微生物区系未受到影响。而Sarker等于2016年再次报道，79名小儿腹泻患者在接受噬菌体治疗时，未出现任何不良反应，肝功能、肾功能和血常规指标均显示正常。
上述试验再次论证了噬菌体的临床安全性。不过目前认为，对于任何拟用于临床的噬菌体制剂安全性评价研究，除设置必要的对照试验、随机化试验、盲法试验、志愿者试验等外，还应取得权威部门授权并接受严格监管，以保障客观性与公正性。据Wright等报道，一项经英国药监局和伦理委员会中央局授权与监督的Ⅰ期/Ⅱ期临床试验被开展，以评价噬菌体制剂的安全性，结果表明12名患者在接受噬菌体治疗时，未出现任何不良反应。另据Ｒhoads等报道，一项经美国食品药品监管局（FDA）授权与监管，并且由临床医师负责指导实施的Ⅰ期临床试验表明，噬菌体的使用并未产生任何严重的副作用。值得注意的是，为保障噬菌体制剂的临床用药安全及稳定其质量，除进行必要的临床监测外，开展质量控制研究，亦尤为重要。
Merabishvili等对Eliava研究所生产的某种噬菌体制剂进行了稳定性、致热源性、细胞毒性和无菌性等检测，并对制剂中的噬菌体进行了透射电镜观察、基因组学分析和蛋白质组学分析，结果表明，该制剂中噬菌体均为专性裂解性噬菌体，且未携带任何毒力因子；该制剂稳定性较高，不含细菌毒素，亦未受微生物污染；在对家兔静脉接种该制剂后，未引起体温的明显升高(+0.5℃)；将该制剂与人体角质细胞共培养，噬菌体未表现出细胞毒性，人体角质细胞仍可正常增殖，且未出现病变。
综上所述，无论是东欧地区近百年来的噬菌体临床治疗实践，还是欧美等国近年来开展的一系列安全性研究，均表明噬菌体具有较高的临床安全性。即使对于免疫功能不全患者，噬菌体的使用也未引起任何副作用。实际上，目前已有许多商业化噬菌体制剂获得权威机构批准，并取得安全认证，如一种名为Stafal的制剂，已在捷克和斯洛文尼亚获批。这种制剂通过局部给药的方式，可用于去除皮肤感染或用于预防化脓性感染。其他如AgriphageTM、ListexP100、EcoShieldTM、SalmoFreshTM、BioTector等制剂，也已获得相关机构批准，可用于食品或动物饲料。值得注意的是由Intralytix公司开发的一种噬菌体制剂ListShieldTM，该制剂早在2006年就已获FDA批准，并被授予一般公认安全（GＲAS）认证，这是近代第1款获得安全认证的噬菌体制剂。此后，该制剂又获得澳新食品标准局（FSANZ）与欧盟相关机构的认证。这一系列里程碑式的事件，不仅推动了噬菌体治疗研究的发展，更有力地论证了噬菌体的安全性。
小结
噬菌体被认为不会感染人体细胞，它们作抗菌剂使用不会产生明显的副作用和毒理作用，且不会破坏机体的正常菌群、引发严重的内毒素血症。将其开发为抗生素替代物应用于医学或兽医学领域，或开发为食品抗菌剂应用于食品工业，前景光明。
文章摘选于《江苏农业科学》2017年第45卷第22期